产品简介: TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是检测细胞凋亡的经典方法。本试剂盒采用TUNEL法,应用高活性的基因重组末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂的DNA 3’-羟基(3’-OH)末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP),通过检测FITC-12-dUTP标记的DNA的片段来检测细胞凋亡。FITC-12-dUTP记的DNA可以用荧光显微镜直接观察,也可用流式细胞仪检测。本试剂盒已经多次优化,FITC-12-dUTP标记和未标记dNTP处于*搭配比例,这样在进行3’-OH末端核苷酸掺入时,同一个断裂的DNA的片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP掺入,从而大大提高了检测的灵敏度,减少了背景反应。再加上我们高活性的TdT酶,使得本试剂盒的检测信噪比大大提升,而背景非常干净。
TUNEL FITC末端荧光标记凋亡检测试剂盒的特点:
试剂盒包装 产品组成
货 号 | 规 格 | 价格(元) |
21013 | 20T | 1680 |
21014 | 50T | 3060 |
组 分 | 20T | 50T |
5×Equilibration Buffer | 1.25ml | 1.25ml×2 |
FITC-12-dUTP Labeling Mix | 100ul | 250ul |
Recombinant TdT Enzyme | 20μl | 50μl |
Proteinase K (2mg/ml) | 40μl | 100μl
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方法步骤:
注意:为得到的结果,蛋白酶K孵育时间可能需要优化。
3) 在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉多余的 Equilibration Buffer,不要让组织或细胞发干, 然后在组织或细胞上加50ulTdT孵育缓冲液。
4) 把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布,在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾,将载玻片置于湿盒内,再将湿盒用铝箔纸包裹以避免光照, 37℃孵育60分钟。
表1.准备用于实验和阳性对照反应的TdT孵育缓冲液
组 分 | 体 积 (µl/50µl体系) | 样本数目 (实验+阳性对照数) | 总体积 (µl) |
dd H2O | 34 |
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5×Equilibration Buffer | 10 |
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FITC-12-dUTP Labeling Mix | 5 |
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Recombinant TdT Enzyme | 1 |
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5) 移除盖玻片,并将切片置于PBS溶液中室温孵育5分钟。
6) 轻轻去掉多余液体,换用新鲜的PBS溶液室温孵育5分钟。重复该步骤1次。
7) 用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。
注意:为了降低背景,可以尝试载玻片在步骤5用PBS洗一遍之后,再用含0.1% Triton® X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次(取代步骤6),每次5分钟,这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
8) 将载玻片浸入装有PI溶液的染色缸,暗室室温放置5分钟,此 处PI溶液是用PBS新配稀释到1µg/ml的。
9) 洗涤样本,将载玻片浸入去离子水中,室温放置5分钟,共洗三次。
10) 将载玻片上多余的水吸干,但组织或细胞保持湿润。
11) 立即在荧光显微镜下分析样本,用标准的荧光过滤装置在520 ± 20 nm的荧光下观察绿 色荧光。在>620 nm下观察PI的红色荧光。如有必要,载玻片可在4℃ 黑暗条件下存放隔夜。
3. 阳性对照制备:如有必要,可按下述制备阳性对照。
1) 在样本预处理之后,加100ul DNA酶I缓冲液到固定的细胞上,室温孵育5分钟;
2) 轻去液体,加入100µl含5.5-10units/ml DNA酶I的缓冲液,室温孵育10分钟;
3) 轻叩载玻片去掉多余的液体,并将载玻片在装有去离子水的染色缸中*洗3-4次。
注意:阳性对照载波片必须使用单独的染色缸。否则来自阳性对照载玻片上残余的DNA酶I活性可能会在实验载玻片上引入高的背景。
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